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前沿拓展：

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中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所 李呈軍、步志高和陳化蘭發表了題為Avian influenza vaccines against H5N1‘bird flu’的綜述，這是一篇教科書級別重要論文。

H5N1禽流感病毒傳播廣泛，跨越3個大陸60余個國家。為控制該病，許多感染國家，尤其是H5N1已經在禽類和野鳥中呈地方性流行的國家，對禽類實施免疫。近來，禽流感疫苗的研制，尤其是重組病毒載體疫苗和DNA疫苗的研制，取得了很大進展。

本文章探討在H5N1禽流感疫苗的研制和使用方面取得的最新進展。了解新疫苗的特性有利于國家免疫程序的制定，從而有助于有效控制和阻止H5N1禽流感傳播。

為了方便閱讀，我們將分兩篇講述陳化蘭院士團隊的這篇論文。本篇先介紹H5N1禽流感疫苗的研制取得的最新進展。

本部分內容大綱

一、滅活的全病毒疫苗

二、重組病毒載體疫苗

1.禽痘病毒載體疫苗

2.新城疫病毒載體疫苗

3.火雞皰疹病毒載體疫苗

4.鴨腸炎病毒載體疫苗

5.傳染性喉氣管炎病毒載體疫苗

三、DNA疫苗

一、滅活的全病毒疫苗

在20世紀40年代，滅活的全病毒疫苗問世，用來控制和阻止人流感。在過去的30年中，這種疫苗是養禽業用以控制禽流感病毒的重中之重。

為了抗擊印度尼西亞爆發的H5N1禽流感，一種以高致病性疫苗種毒A/chicken/Indonesia (Legok)/03 (H5N1)研制出的滅活疫苗被用來免疫雞。

然而，選擇一種高致病性的病毒作為疫苗種毒存在很多問題。例如，在生物安全方面，高致病性的病毒對疫苗生產部門有潛在威脅。另外，高致病性H5N1疫苗種毒經常在48小時內殺死雞胚，使得尿囊液中病毒滴度很低。

使用傳統的方法不能研制低致病性H5N1疫苗種毒。反向遺傳技術的發展和應用引發了H5N1流感疫苗的變革。使用這種技術，表達H5N1病毒HA和NA基因質粒的病毒RNA，高產病毒A/Puero Rico/8/1934 (H1N1)（PR8）的六個內部基因，以及編碼多聚酶和核蛋白的四個PR8蛋白表達質粒共同轉染Vero細胞，產生病毒RNA和蛋白，形成H5N1/PR8疫苗種毒（見圖1）。

圖 1.制備H5N1疫苗種毒的反向遺傳操作系統示意圖

在病毒RNA表達質粒的構建過程中，在HA裂解位點去除多個堿性氨基酸，使其變成低致病性流感病毒。

通過使用反向遺傳技術，田國彬等人研制出了一種基于A/goose/Guangdong/1/96（在中國分離到的第一株高致病性H5N1病毒）的H5N1滅活禽流感疫苗，并將其命名為H5N1/PR8（2+6）。這種疫苗種毒具有極好的生物安全特性。它在雞體致弱，對雞胚無致病性。這種疫苗種毒在雞胚中有效復制，尿囊液中病毒滴度比A/goose/Guangdong/1/96病毒增長46倍。因此，可以直接利用尿囊液制備滅活疫苗而不用進一步純化。用這種疫苗免疫后再攻擊同源或異源性H5N1病毒，雞、鴨、鵝都能被完全保護。

大量研究也證明了滅活全病毒疫苗對抗H5N1感染的免疫效力。

這些研究中的疫苗種毒來自于低致病性H5N2和H5N9病毒，或者來自于通過反向遺傳技術基于PR8拯救的H5N1或H5N3疫苗種毒。

這些研究中的疫苗效力也各不相同，包括完全保護、部分保護、發病、死亡等等。

疫苗的免疫效果與疫苗抗原性、攻擊的毒株、HA抗原量、免疫程序相關。在這些因素中，疫苗種毒與野毒的抗原高度一致性對抗擊H5N1病毒，發揮免疫保護至關重要。當抗原出現變異時，這些疫苗便不能完全保護。因此，實時監測、抗原性分析、及時更新疫苗毒株就顯得至關重要。

二、重組病毒載體疫苗

和滅活疫苗相比，重組的病毒載體疫苗能夠引發更多的輔助性T細胞（Th1和Th2）產生免疫反應。總的來說，用其他病毒作載體研制的重組H5N1禽流感疫苗可以對兩種病毒疾病提供保護，這使得管理便利，成本減少。而且，重組疫苗只表達H5N1病毒的HA基因，這有利于通過血清學檢測來區分感染病毒的亞型。

目前為止，一系列基于不同病毒載體的重組H5N1流感疫苗已經被研制出，這些載體包括禽痘病毒載體、新城疫病毒載體、火雞皰疹病毒載體、鴨腸炎病毒載體以及傳染性喉氣管炎病毒載體（見表1）。

表1.高致病性H5N1禽流感的多種重組病毒載體疫苗

1.重組禽痘病毒載體疫苗

重組禽痘病毒載體疫苗是第一個通過使用基因工程成功研制的活載體疫苗。

重組禽痘病毒載體疫苗在1988年首次研發、注冊并用于控制墨西哥H5N1禽流感病毒。免疫這種疫苗的雞，即使其抗體水平較低甚至沒有，也能受到保護。

這表明，該疫苗引發的細胞免疫在免疫保護中發揮重要作用。

表達A/goose/Guangdong/1/96病毒HA和NA基因的重組禽痘病毒載體疫苗在中國已經被批準使用。它可以保護雞不受H5N1和H7N1高致病性病毒的致死性攻擊。研究表明，這種疫苗產生的中和抗體可以持續存在40周。在免疫后一周，重組禽痘病毒載體疫苗就能對同源性流感病毒的攻擊產生保護力。

重組禽痘病毒載體疫苗有幾個缺點。

首先，免疫這種疫苗不能保證完全無毒，這從喉頭和泄殖腔拭子排毒可以看出。

其次，免疫效果可被禽痘病毒的母源抗體干擾。在使用這種重組禽痘病毒載體疫苗之前使用傳統的禽痘病毒疫苗會干擾重組疫苗的效果。

第三，這種疫苗需要通過翅靜脈穿刺或皮下注射免疫，耗費人力，引起不便。

最后，對肉雞使用這種疫苗沒有優勢，因為肉雞不必免疫禽痘病毒疫苗。

因此，對肉雞來說，這種想要通過一種疫苗來對抗兩種傳染病的目的并沒有達成。

2.重組新城疫病毒載體疫苗

新城疫是一種由新城疫病毒引起的高感染性疾病。在許多國家，肉雞場使用弱毒活新城疫疫苗是必不可少的。每年弱毒新城疫疫苗的使用劑量僅中國就達到了三百億。因此，使用弱毒新城疫疫苗來研制一種重組新城疫載體H5禽流感疫苗可以同時阻止兩種致死性傳染病：禽流感和新城疫。

Swayne等人通過一種高度致弱的B1毒株構建了一種表達H7禽流感病毒HA基因的重組新城疫病毒，這種病毒在對抗高致病性H7禽流感和新城疫中提供部分保護。相比之下，利用輕微致弱的Lasota株或它的衍生物Clone30構建的重組新城疫疫苗能更好的引發抗體反應，提供免疫保護。葛金英等人，以及Nayak等人的研究表明，使用Lasota株，并表達H5N1禽流感病毒HA基因的重組新城疫疫苗能夠引發很好的抗體反應，并對新城疫病毒和同源以及異源H5N1禽流感病毒的致死性攻擊提供完全的免疫保護。

和滅活疫苗相比，重組新城疫疫苗對抗原性不同的H5N1病毒的免疫保護效果有所下降。因此，當發現抗原變異時，對重組新城疫病毒載體疫苗中的H5的HA基因進行更新必不可少。

另外，母源新城疫抗體會干擾重組新城疫活疫苗的免疫效果。因此，需要根據母源抗體的水平來優化免疫程序。重組新城疫疫苗和重組禽痘病毒疫苗聯合使用可以對抗H5N1病毒，提供長期的免疫保護。

二價重組新城疫病毒載體H5HA疫苗有幾大優點，包括生產簡單、高產、免疫方法便捷、可引發黏膜免疫等。

3.重組火雞皰疹病毒載體疫苗

火雞皰疹疫苗已被廣泛使用于控制馬立克氏疾病并被用來研制重組二價疫苗以對抗傳染性法氏囊和新城疫。

火雞皰疹病毒載體疫苗免疫方便，可通過雞胚（18日齡雞胚）免疫或雞群免疫（1日齡雛雞）。使用傳染性細菌人工染色技術（BAC），將H7的HA基因插入到火雞皰疹病毒的UL4546之間，構建重組火雞皰疹病毒載體H7疫苗。免疫1日齡雛雞后攻擊同源H7N1病毒，能夠提供完全保護，不排毒，不發病，不死亡。

幾個相關研究也檢測了重組火雞皰疹病毒載體H5HA疫苗的免疫效力。對于重組火雞皰疹病毒載體H5HA疫苗，H5的HA基因插入到US2位點比插入到US10位點能提供更好的保護。它可以對抗原相關H5N1病毒提供臨床保護，但是對抗原突變株的免疫保護力下降。

有趣的是，對有母源火雞皰疹病毒抗體和母源H5N1禽流感抗體的商品肉雞攻擊H5N1禽流感病毒，重組火雞皰疹病毒H5HA疫苗仍能提供70%90%的臨床保護。

為增強火雞皰疹病毒載體疫苗的免疫效力，需對不同的免疫程序例如疫苗的劑量進行進一步的研究。

4.重組鴨腸炎病毒載體疫苗

感染H5N1禽流感病毒的鴨通常不發病或死亡，但是向環境中大量排毒。因此，在H5N1病毒傳播給易感動物和人時，鴨相當于“木馬”。

H5N1病毒的木馬計,鴨子“木馬 ”

在亞洲國家，鴨的養殖數量十分巨大。僅中國每年鴨的養殖量就達到40億只，相當于全世界的75%。但是，由于H5病毒不會對鴨產生明顯疾病，鴨農不愿使用滅活H5N1疫苗，因而，鴨的免疫覆蓋區域很小。

鴨病毒性腸炎是由鴨腸炎病毒引起的一種致死性傳染病。

從20世紀60年代起，弱毒活鴨腸炎病毒疫苗已經被研制出，并在中國定期使用來控制鴨病毒性腸炎，每年該疫苗的使用劑量能達到幾十億。因此，研制一種重組鴨腸炎病毒載體H5禽流感疫苗有很大優勢，因為它能被用來同時控制鴨病毒性腸炎和H5N1禽流感病毒（見圖2）。

圖 2.一種對抗H5N1禽流感的新型鴨腸炎病毒載體疫苗的研制過程

Liu等人研制了兩種重組鴨腸炎病毒載體H5HA疫苗，H5的HA基因分別插入到鴨腸炎病毒基因組的不同位置。實驗研究證明，這些鴨腸炎病毒載體疫苗具有免疫原性，并能對H5N1禽流感病毒和鴨腸炎病毒產生堅實保護。

這種疫苗最大的優點是產生保護效力的速度很快，在免疫的當天便可對鴨病毒性腸炎的攻擊產生完全保護，在免疫后7天，就可對抗H5N1禽流感病毒的攻擊（見圖2A和表1）。這種疫苗的使用可以成功降低鴨對H5N1禽流感病毒的易感性，從而減少或消除傳染源，同時還能有效對抗鴨腸炎病毒。

重組鴨腸炎病毒載體H5疫苗對雞也安全有效。7日齡肉雞免疫該疫苗一周后，可產生免疫保護，并在肉雞的整個生長階段產生持續保護（見圖2C和表1）。

與其他的重組疫苗不同，重組鴨腸炎病毒載體疫苗可使雞完全免于母源抗體的干擾。這種重組病毒能在雞胚成纖維細胞上大量繁殖，可降低成本。另外，重組鴨腸炎病毒載體疫苗種毒可在23周內生產出，確保了新疫苗種毒的快速更新，從而應對H5N1野毒的抗原性漂移。

5.傳染性喉氣管炎病毒載體疫苗

使用同源重組，將H7的HA基因插入到傳染性喉氣管炎病毒的UL0基因中，構建出重組傳染性喉氣管炎病毒載體H7禽流感疫苗。這種疫苗可對傳染性喉氣管炎病毒和H7禽流感產生免疫保護。

另外，將H5的HA基因插入到傳染性喉氣管炎病毒的UL50基因轉座子中構建的重組傳染性喉氣管炎病毒載體疫苗可對同源和異源H5病毒的攻擊產生有效保護。

當雞同時免疫一種重組傳染性喉氣管炎病毒載體N1禽流感疫苗時，重組傳染性喉氣管炎病毒載體H5禽流感疫苗的效力增強。

重組傳染性喉氣管炎病毒載體疫苗可在雞胚或原代細胞系上大量繁殖，通過飲水或噴霧引起黏膜免疫。

然而，重組傳染性喉氣管炎病毒載體疫苗僅在傳染性喉氣管炎病毒流行的少數區域的層養雞中使用。因此，和其他重組疫苗相比，這種疫苗在控制H5N1禽流感病毒中的作用有限。

三、DNA疫苗

和傳統疫苗相比，DNA疫苗有很多優點。

首先，DNA疫苗可產生體液免疫和細胞免疫。

其次，DNA疫苗構建簡單，生產、儲存成本低。

第三，DNA疫苗可多次免疫來增強免疫效力。

盡管對流感病毒的多種病毒基因進行了研究，在研制DNA疫苗中還是HA基因的保護效果最好。

幾個早期的研究表明，表達HA基因的DNA疫苗能有效對抗高致病性H5或H7禽流感病毒。

最近，科學家們致力于研究能更有效對抗H5N1的DNA疫苗。姜永萍等人，構建了一種H5的HA基因optiHA。將optiHA插入到pCAGGS載體中表達構建出一種針對H5亞型禽流感病毒的DNA疫苗。肌內注射后，這種DNA疫苗能產生高HI和中和抗體。免疫100微克或10微克這種DNA疫苗，可完全保護雞免受H5N1禽流感病毒的攻擊。進一步研究表明，當免疫兩次10微克這種DNA疫苗，產生的免疫保護效果可持續一年多。這種DNA疫苗經過了臨床試驗，其在中國的合法性目前在評估中。

探討DNA疫苗的廣譜免疫反應也有研究。DNA疫苗可對同源性H5N1病毒提供保護。

另外，佐劑，例如MDA5和CD154，可增強DNA疫苗對抗H5N1病毒的免疫效力。

DNA疫苗在鵪鶉中也可發揮保護作用。將來需要進一步研究DNA疫苗在其他禽類如鴨和鵝中的免疫效果。

總結

H5N1禽流感病毒在禽類和野鳥中導致了嚴重的疾病。實施免疫在減少養禽業損失、降低環境中病毒濃度、確保生物安全、阻止病毒從禽類傳播到人等方面發揮了重要作用。經驗告訴我們，現代生物技術，例如反向遺傳技術，使得流感疫苗的研制更加容易，并可使疫苗具有我們想要的特性，如高繁殖率、低致病性、高免疫原性。

為確保免疫策略在將來依舊有效，必須加快研究不同種類的疫苗，建立最佳動物模型。建立動物模型應該考慮動物的種類、年齡、免疫后的狀態以及不同疫苗聯合使用的潛在可能性。例如，依據種屬設計的重組鴨腸炎病毒載體疫苗在鴨上使用最佳。這解決了在鴨群中極少免疫H5N1疫苗的問題。我們希望這種新的疫苗在不久的將來能極大地減少環境中的病毒量并減少H5N1病毒在禽類中爆發。

未完，待續，明天我們將介紹H5N1禽流感疫苗使用方面的研究進展。

本文由白潔翻譯，周盼伊整理編輯，轉載請注明出處。

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